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食品专业完整的一片毕业论文-乳酸发酵香肠的研制

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增大字体作者：佚名来源：本站整理发布时间：2010-09-19 16:52:00

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乳酸发酵香肠的研制

摘要：本研究利用自行筛选的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂，以猪肉为原料进行发酵制备发酵香肠。研究确定了制品的最适配方：肥瘦肉100%、白砂糖2%、盐3%、味精0.2%、白胡椒粉0.25%。确定了最适工艺条件：乳糖添加量0.75%、接种量为3%、发酵温度37℃、发酵时间12h。制品色泽均匀，瘦肉切面呈玫瑰红色，香味浓郁纯正，有发酵型乳酸香肠持有的酸味，润滑的质构，口感舒适。

关键词：发酵香肠乳酸菌筛选川洋食品

Abstract: In this study, the self-screening Lactobacillus Bulgaricus and Streptococcus Thermophilus were used as fermentation starter; pork was used as raw materials for producing fermented sausages. The study determined the optimal components of products, which were 100% fat meat, percent, 2% sugar, 3% salt, 0.2% MSG, and 0.25% white pepper. The optimal fermentation conditions were determined: 0.75% lactose content, 4% inoculation volume, fermentation temperature 37℃, fermentation period 12h. Products was color uniformity, cut surface submitted lean red roses with strong and pure flavour, and characteristic lactic acid flavour, lubricatied texture.

Key words: fermented sausage; lactobacillus; screening

1　前言

发酵香肠由于其采用乳酸菌为生产菌种，加工工艺独特，产品营养价值高、易消化，可在室温条件下长时间保持稳定的品质，食用方便，具有独特的风味和一定的嗜好性，在营养和保健方面有一定的优势。然而发酵肉制品在我国目前还处于起步阶段，有关乳酸在中式香肠中的应用报道较少^[1]。国内外主要研究热点在于发酵和成熟过程中的微生物变化以及生产工艺条件对最终产品质量的影响。近年来，国外有许多研究人员致力于研究酶制剂对发酵香肠发酵和成熟的作用。主要目的是试图用酶(如蛋白质酶和脂肪酶,多以微生物来源)取代发酵剂添加于发酵香肠中，以求达到微生物作用的效果，缩短成熟时间^[2]。本研究结合我国传统发酵技术，从筛选菌种、工艺参数优化等方面开发研究用乳酸菌发酵制作具有独特风味，符合中国人的饮食文化、无需冷藏保存等特点的发酵香肠制品，具有较大的市场发展前景。

2　材料和方法

2.1　材料与设备

2.1.1　试验原料及处理

猪肉、肠衣：购于广州家乐福；香辛料、腌制剂：购于食品调味厂

选择新鲜、腿肉和臂部上的瘦肉和肥肉为背部硬膘。从用流动水清洗市场买回的猪肉，洗去泥沙等杂质，去皮、骨、结缔组织膜、脂肪和筋腱，使其成为纯精肉。用作发酵香肠的瘦肉的pH值应控制在5.4~5.8之间^[3]。按瘦肥肉比7:3，将其切块后放在榨汁机绞碎,肥膘切丁待用。

2.1.2试验菌种

保加利亚乳杆菌(L.b)，嗜热链球菌(S.t)均筛选于市场销售的玻璃瓶装燕塘酸奶

2.2　方法

2.2.1　工艺流程

菌种活化

↓

腌制剂、香辛料种子液

↓ ↓

瘦肉→绞碎→搅拌→腌制(12h) →接种乳酸菌→灌肠→发酵

↑ ↓

肥肉丁产品 ←成熟← 干燥

2.2.2　工艺操作要点

2.2.2 1　香肠配方

猪前腿瘦肉70%，背部肥膘30%，白砂糖2%，盐3%，味精0.2%，白胡椒粉0.25%，NaNO210 mg/kg。

2.2.2 2　制备方法

把绞碎的瘦肉与切丁后的肥膘混匀，按配方加入辅料，在0～5℃下进行腌制12h后,在无菌条件下,加入活化后的发酵剂混和均匀，灌装在晾干的猪肠衣中(10～15 cm为一节)，然后排气、漂洗，在37℃下发酵12h，保持40℃条件24 h干燥成熟，冷却后真空包装，在常温下贮藏。

2.2.2.3　菌种的活化分离与驯化

菌种取自燕塘酸奶，由于保藏条件抑制了菌种的代谢和繁殖，使菌种的活力减弱，因此，分离前必须进行活化^[4]。活化采用10%的奶粉，溶解后加热到沸腾维持5min，分装于灭菌试管中，加入1%的燕塘酸奶，在适宜的温度下培养，经2~3次传代，菌种已活化。用无菌水稀释一定量的活化液，吸取1mL稀释液涂布于培养基上，置于37℃的培养箱中培养。48h后，分别从MRS培养基^[5]、LAB培养基和PYG培养基中选择一到两个生长较好的培养皿，然后挑取不同形态的菌落进行革兰氏染色镜检。同时，挑取不同形态的单菌落划线于新制备的优势固体培养基，在37℃的温度下进行单菌种分离，将分离的菌种保存备用。

将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按照酸奶中1:1的比例接种到肥瘦肉混合物:牛奶=5:5的混合培养基中(以10mL为标准，以下同)，在适宜的温度下培养。发酵后，取1mL发酵混合培养基加入新配制的(5:5)混合培养基中驯化多一次，然后取1mL二次(5:5)发酵混合培养基加入肥瘦肉混合物:牛奶=6:4的混和培养基中，依照相同的步骤，依次加入肥瘦肉混合物:牛奶=7:3、8:2、9:1的混合培养基中，进行递次驯化。将(9:1)驯化液保存备用。

2.2.2.4　种子液的制备(锥形瓶)

将制备好的(9:1)驯化液加入添加了乳糖的肥瘦肉混合物中，37℃培养48h后置于冰箱备用。

2.2.4.5　肥瘦肉比的确定

取瘦肥肉比分别为8:2、7:3、6:4、5:5、4:6进行发酵香肠肥瘦肉比的确定试验。通过pH的变化及肠体重量的变化来确定最佳肥瘦肉比。

2.2.4.6　影响发酵香肠的单因素试验

(1)　不同乳糖添加量对香肠乳酸发酵pH变化的影响

将乳糖按不同比例(0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.50%)添加到肥瘦肉的混合物中，发酵温度为37℃，接种量为3%，发酵时间为12h进行发酵，根据发酵液最后pH值确定乳糖最适添加量。

(2)　不同接种量对香肠乳酸发酵pH变化的影响

将菌种按不同比例(2%、3%、4%、5%)添加到肥瘦肉的混合物中，发酵温度为37℃，乳糖添加量为1.00%，发酵时间为12h进行发酵，根据发酵液最后pH值确定最适接种量。

(3)　不同发酵温度对香肠乳酸发酵pH变化的影响

将制备好的发酵香肠发酵液放置不同的温度(35℃、37℃、39℃、41℃)中，乳糖添加量为1.00%，接种量为3%，发酵时间为12h进行发酵，根据发酵液最后pH值确定最适发酵温度。

(4)　不同发酵时间对发酵香肠乳酸发酵pH变化的影响

将制备好的发酵香肠发酵液经过不同的时间段(6h、12h、24h、36h)，乳糖添加量为1.00%，发酵温度为37℃，接种量为3%进行发酵，根据发酵液最后pH值确定最适发酵时间。

2.2.4.7　发酵香肠乳酸发酵最佳发酵工艺参数的确定

根据上述单因素发酵试验的结果，以乳糖添加量、接种量、发酵温度和发酵时间为因素，采用正交表L₉(3⁴)进行正交试验。因素水平表见表1。

表1　发酵工艺参数正交试验因素水平表

水平	因素
水平	A乳糖添加量(%)	B接种量 (%)	C发酵温度 (℃)	D发酵时间 (h)
1	0.75	2	35	6
2	1.00	3	37	12
3	1.25	4	39	24

2.2.4.8　香肠干燥和成熟

将发酵结束的香肠，放在干燥室内进行晾挂干燥成熟，室温控制在40℃左右，相对温度由高到低逐渐下降，至肠制品失重大于20%为止^[3]。

2.2.5指标测定及数据处理方法

2.2.5.1　感官评价

对发酵香肠发酵进行感官分析采用评分检验法^[6^，7]。分析评价的指标有色泽、气味、口感和组织状态，各指标评分的标准见表。感官综合评分为四个指标评分之和，即感官综合评分=色泽评分+气味评分+口感评分+组织状态评分。

2.2.5.2 理化指标测定及微生物指标的测定方法

(1)　pH值的测定：用pH酸度仪测定。

(2)　乳酸菌菌落总数的测定^[4]

(3)　大肠菌群的测定^[8]

(4)　致病菌菌落的判定

根据伊红美蓝固体培养基上生长出来的菌落形态进行判断。

3　结果与讨论

3.1　菌种培养基的选择

试验选用MRS培养基、LAB培养基、PYG培养基进行对比。由于保加利亚乳杆菌(L.b)和嗜热链球菌(S.t)在相同生长条件下对不同的培养基有所选择，菌种生长的时间和菌落的大小各不相同。

表2　不同培养基中乳酸菌菌落生长总数

培养天数(d)	菌落总数
培养天数(d)	MRS(A)	LAB(B)	PYG(C)
1	0.79×10⁷	0.47×10⁶	0.51×10⁷
2	0.95×10⁷	0.64×10⁶	0.84×10⁷
3	1.12×10⁷	0.74×10⁶	0.89×10⁷

在37℃条件下培养3d，每隔1d测一次菌落总数及观察菌落大小。3d后，三种培养基中均能生长出一大一小的两种菌落。其中，MRS培养基上的菌落相对多，且菌落较大，PYG和LAB培养基次之。

图1　不同培养基中乳酸菌菌落生长总数

图2　嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌

从表2和图1可以看出，在MRS培养基上乳酸菌生长最多。通过试验证明，由于MRS培养所含成分比较全面，其中，蛋白胨和牛肉膏为乳酸菌提供氮源，酵母膏为乳酸菌提供氨基酸类，维生素类和无机盐类，还有其他成分所提供的各类营养因子。故选用MRS培养基作为菌种分离的培养基。

3.2　肥瘦肉比的确定

香肠原料肉的肥瘦肉比对产品质量也有很大的影响。肥肉太多影响人们的食欲和口感，瘦肉太多一方面会提高成本，另一方面由于瘦肉较肥肉含水量为高，发酵速度较快，失水“出汗”严重，因而会降低产品质量及出品率。

图3 不同肥瘦肉比对发酵香肠产酸的影响　　　　图4 不同肥瘦肉比对发酵香肠重量（g）的影响

从图3、4可以看出，随着原料肉中瘦肉比例的增大，肠体产酸速度加快，重量也随之迅速下降。如图所示，瘦肥肉比为7:3、6:4、5:5时，发酵12h后pH均达到标准范围以内，且当肥瘦肉8:2时，发酵香肠的重量下降了6.93g，重量损失较为严重。当瘦肥肉比小于7:3时，一方面产酸速度上升太慢，发酵时间过长，另一方面，成熟香肠含大量脂肪，不易被人们所接受，因而选择7:3为最佳瘦肥肉比。据报道^[2]：瘦肥肉比为6:4时为最佳瘦肥比。本试验选择瘦肥比为7:3为最佳比，两者并不存在冲突，分析原因如下：区域、习俗不同，人的口感有差异，发酵温度时间不同，肠体的风味营养物质不同。

3.3影响发酵香肠的单因素试验

3.3.1　乳糖添加量的确定

香肠中总糖的含量不高，不够提供保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵的糖类^[9]。

图5　不同乳糖添加量对发酵香肠研制的影响

由图5可以看出，随着时间的增长，各发酵液的pH值都呈现统一的下降趋势。由于本研究以发酵pH值在4.5~4.8之间为标准，因此，在相同的发酵时间下，pH值越接近标准而且菌种活力越强的发酵液设为优势水平。乳糖添加量为0.25%、0.5%的发酵香肠发酵效果差一些，12h后，发酵液的pH值远远不能达到标准，而乳糖添加量为1.25%时12h后pH值过低，也超出了本试验的标准范围。其他两个水平的pH值均可达到标准。综合感官评价，结果表明，乳糖添加量为1.0%的发酵香肠效果最好，产酸幅度不错，口感较佳。

通过研究结果表明，乳糖的添加量太少，菌种未能得到充足的营养给予，发酵效果不好，当乳糖添加量达到一定量时，菌种不仅能够充分的利用，而且生长能力也较强，但是当乳糖的添加量过多，产酸变化不大，且产品过酸影响感官风味。故选择乳糖添加量为1.0%作为以下单因素的最适水平。

3.3.2　接种量的确定

接种量对于产酸的影响主要在于一定范围内，适当增加发酵剂添加量，可以缩短甚至消除延滞期，加快产酸的速度。

图6　不同接种量对发酵香肠的影响

从图6可以看出，随着接种量的增加，pH值逐渐下降。其中接种量为3%和4%发酵香肠的最终pH值都在标准范围以内，但接种量3%的发酵香肠感官评价最佳。12h发酵后，接种量2%的发酵香肠pH值下降很慢，还没达到试验标准pH值，接种量5%的发酵香肠发酵速度过快，发酵12h后，pH值都超出了预定的范围，感官评价结果显示，接种量3%是最佳。

试验结果表明，接种量少时，菌种未能在规定时间内快速利用可发酵性物质，发酵效果不好，当接种量相对多时，菌种对发酵液中的可发酵性物质利用过于充分，致使发酵前半段时间乳酸产速快，而后半段时间由于缺乏可发酵性物质而产酸受阻。故本试验将接种量3%确定为单因素的最适水平。

3.3.3　发酵温度的确定

保加利亚乳杆菌的最适生长温度一般为35~41℃。嗜热链球菌的最适生长温度稍低。如果温度低，则嗜热链球菌生长旺盛，L(+)乳酸的比例增大，酸味不足且达到规定酸度的时间较长。如选用的培养温度高，则保加利亚乳杆菌生长旺盛，D(-)乳酸的比例大，出现刺激性较强的酸味。由此可见发酵温度对于产酸量、产品风味等有很大影响。

图7　不同发酵温度对发酵香肠的影响

从图7中可以看出：不同的发酵温度发酵香肠的pH值变化不同，在35~41℃范围内，其pH值变化随温度的升高而加快。发酵温度为37℃、39℃的发酵香肠在发酵12h后pH值已经下降到4.5~4.7。发酵温度为35℃的发酵香肠发酵效果不理想，经过12h的发酵，pH值不在试验标准范围内。发酵温度为37℃和39℃的发酵香肠相对较好，pH值变化也相对合理。

试验结果证明，在发酵香肠发酵过程中，35~39℃的发酵温度相对适合试验菌种的生长，此温度范围的发酵pH值在试验标准范围内。比较35℃、37℃、39℃发酵温度下对香肠的感官评价，其中以37℃发酵温度下的发酵出来的香肠分数最高，39℃、35℃次之。故选用37℃作为发酵香肠发酵最适温度。

3.3.4　发酵时间的确定

将制备好的发酵香肠发酵液经过不同的时间(6h、12h、24h、36h)，乳糖添加量为0.75%，发酵温度为37℃，接种量为4%进行发酵。试验结果表明，随着发酵时间的增长，pH值呈下降趋势，即乳酸菌的产酸量越来越多。在0~12h之间，pH值下降幅度很大，乳酸菌在此时间内，活力强，产酸快；当发酵时间为36h时，pH值和24h的pH值相近，此时乳酸产酸能力降低。在发酵香肠发酵过程中，由于试验标准范围是4.5~4.8，发酵时间为6h的发酵效果不理想，达不到标准；而发酵时间为12h的pH值在试验标准范围内，而且在感官评价分析中，12h发酵时间的分数最高，发酵时间为24h、36h的pH值过低。故选用12h作为发酵香肠发酵的最适发酵时间。

图8　不同的时间对发酵香肠pH的影响

3.4 最佳发酵香肠发酵工艺参数的确定

在分别对乳糖添加量、接种量、发酵温度、发酵时间与pH值变化的关系进行单因素试验的基础上，基本确定了发酵香肠产酸较快时各个因素最佳值的范围。本研究设计了乳糖添加量、接种量、发酵温度和发酵时间正交试验。通过这个正交试验可以找出发酵香肠进行乳酸发酵感官评分最高时，乳糖添加量、接种量、发酵温度、发酵时间4个因素的最佳配合，并了解4个因素感官评分的影响程度。

根据表10可以得出：发酵温度是影响发酵香肠发酵的主要因素，接乳糖添加量次之，第三是接种量，发酵时间相对影响较小，即排列顺序为C>B>A>D。发酵香肠最佳的发酵条件为A₂B₂C₂D₂，即乳糖添加量为1.00%，接种量为3%，发酵温度为37℃，发酵时间为12h。

将得出的组合A2B2C2D2进行验证试验，试验通过感官评价，A2B2C2D2确实是最佳选择，故选择A2B2C2D2此组合为工艺最优组合。

3.5　发酵香肠的产品指标

3.5.1　感官评价

色泽^[10](20分)	气味(20分)	口感(30分)	组织状态(30分)
色泽均匀，瘦肉切面呈玫瑰红色，无杂色(17～20分)	风味协调，香味浓郁纯正，有发酵型乳酸香肠持有的酸味(18～20分)	酸咸适中，润滑的质构，口感舒适(27～30分)	切面光滑，切口平整，质地紧密，细腻。无分裂，少量细磨属正常(26～30分)
色泽不错，带有香肠颜色，颜色呈浅红色(12～16分)	风味一般，香肠味和酸味略显轻淡(13～17分)	稍微带酸或咸，有沙粒感不够润滑(22～26分)	切面光滑，略有分裂，细磨偏多(20～25分)
颜色不一，无香肠的颜色，显得暗淡，有杂色(11分以下)	风味较差，无香肠味和酸味，且有异味(12分以下)	过酸或者过咸，明显的沙粒口感，有其他怪味(21分以下)	分裂很明显，且有大量的细磨(19分以下)

终产品色泽均匀，呈玫瑰红色，香味浓郁，切面光滑，质地紧密、细腻。

表10 发酵工艺参数正交试验方案和试验结果

试验号	A	B	C	D	感官评价 (满分100分)					平均分
1	1	1	1	1	82	84	82	81	83.5	82.5
2	1	2	2	2	92	93	93	92	92.5	92.5
3	1	3	3	3	81	84	82	83	80	82.0
4	2	1	2	3	90	90	89	90	91.5	89.9
5	2	2	3	1	87	88	86	85	87.5	86.7
6	2	3	1	2	86	84	81	85	85	84.2.
7	3	1	3	2	86	83	85	80	83	83.4
8	3	2	1	3	85	86	82	82	82.5	83.5
9	3	3	2	1	83	82	83	81	84	82.6
K1	257.0	255.8	250.2	251.8
K2	260.8	262.7	265.0	260.1
K3	249.5	248.8	252.1	255.4
k1	85.7	85.3	83.4	83.9
k2	86.9	87.6	88.3	86.7
k3	83.2	82.9	84.0	85.1
R	3.7	4.7	4.9	2.8

3.5.2理化指标及微生物指标

项目	指标
pH值	≧4.50，≦4.80
菌落总数个/mL	≦100
大肠菌群个/L	≦3
致病菌	不得检出

3.5.3 亚硝酸盐的测定

亚硝酸盐是肉制品加工过程中常用的发色剂和防腐剂。在一定的酸性条件下,亚硝酸盐分解产生亚硝基,亚硝基很快与肌红蛋白反应生成鲜红色的亚硝基肌红蛋白。亚硝基肌红蛋白遇热后颜色稳定不褪色。但亚硝酸盐与蛋白质分解的中间体二级胺结合形成的亚硝胺,是一种强致癌物质^[11] 。因此, 亚硝酸盐的使用量和残留量均受到严格限制。郭晓红^[12] 指出乳酸发酵能够降低亚硝酸盐的含量, 并随着pH 值的降低而减少,而李先保^[13]等证实, 一般发酵香肠中亚硝酸的残留量约为10μg/ g^[14]。本试验采用组合菌制做香肠,添加亚硝酸盐量10mg／kg ,远远小于国家标准GB5009．33

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